Title: Caracterización enzimática de la β-xilosidasa recombinante Xynb2 bajo condiciones de máxima actividad

Author: Garcia Tejera, Valentina Jose

Abstract: La industria biotecnológica se ha expandido enormemente en los últimos años, y un área de especial interés la constituye la investigación de enzimas provenientes de organismos termófilos, debido a sus altas capacidades catalíticas en condiciones extremas. XynB2 es una β-xilosidasa proveniente del Geobacillus stearothermophilus que presenta atractivas aplicaciones catalíticas siendo hasta ahora la única enzima de este tipo con actividad de transglicosidasa. Aunque ha sido ampliamente caracterizada biofísica y bioquímicamente, no existen estudios detallados sobre la cinética de la hidrólisis de diversos sustratos aril-β-D-xilósidos en las condiciones de mayor actividad, cuyas características son de gran interés para una industria biotecnológica en crecimiento. Debido a ello el presente trabajo buscó caracterizar las propiedades enzimáticas en las condiciones de pH y temperatura donde exista mayor actividad. Primeramente se llevó a cabo la sobreexpresión de la enzima en E. coli C43 empleando el plásmido recombinante pJAVI91, el cual codifica la proteína con una cola de histidina (His-tag) en el codón de terminación, que facilita la purificación mediante cromatografía de afinidad con columna de Ni2+. Posteriormente se empleó una cromatografía de exclusión molecular para eliminar trazas de otras proteínas presentes. Una vez purificada XynB2, se llevaron a cabo diversos ensayos enzimáticos para determinar la temperatura y pH de máxima actividad utilizando p-nitrofenil xilanopiranósido, o-nitrofenil xilanopiranósido y 4-metilumbeliferil xilopiranósido como sustratos. Se calcularon los parámetros cinéticos KM, Vmáx, kcat y kcat/KM a las condiciones de máxima actividad, y se determinó que el sustrato de mayor afinidad resultó ser 4-metilumbeliferil xilopiranósido. También se evaluó la estabilidad térmica de la enzima y el t1/2 empleando los diversos sustratos. Finalmente se estudió el efecto de la xilosa sobre la reacción de hidrólisis del p-nitrofenil xilanopiranósido, reportándose por primera vez una inhibición, la cual resultó ser de tipo competitiva con una KI de 39 ± 12 mM. Palabras clave: aril-β-D-xilósidos, catálisis enzimática, GH52, inhibición por sustrato, xilosidasa.

Description: Trabajo Especial de Grado presentado ante la ilustre Universidad de Carabobo como requisito para optar al título de Licenciado en Química.

URI: http://hdl.handle.net/123456789/4593

Date: 2013-04-10

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