Title: Estudio funcional de una β-xilosidasa mutante (XynB2Y509E) y su inmovilización sobre soportes comerciales naturales y sintéticos

Author: Romero Bracconi, Gabriela Valentina

Abstract: La inmovilización de enzimas es un proceso de gran interés por los beneficios que representa recuperar y reutilizar un biocatalizador. La búsqueda de soportes con características especiales y las diferentes técnicas de inmovilización son el objeto de numerosas investigaciones, de allí que la propuesta principal de esta tesis doctoral haya sido inmovilizar el mutante de una β-xilosidasa de G. stearothermophilus, XynB2^Y509E, utilizando diferentes soportes y técnicas de inmovilización. XynB2^Y509E de G. stearotermophilus fue expresado de manera exitosa en E. coli C43 (DE3), la mutación Y509E produce pocos cambios en la estructura y conformación en comparación con la enzima silvestre expresada en las mismas condiciones con pequeñas variaciones en la concentración del inductor. En la caracterización bioquímica, XynB2^Y509E al igual que la enzima silvestre, se muestra estable en el rango de valores de pH entre 5,5 y 8, reteniendo más del 60% de su actividad luego de 1 h de incubación a 25°C. Respecto al efecto de la temperatura sobre la actividad se encontró un descenso de 5°C en la temperatura máxima de actividad del mutante Y509E cuando se compara con la forma silvestre, que puede explicarse por cambios en fuerzas estabilizadoras como puentes de hidrógeno, luego de la mutación. XynB2^Y509E fue inmovilizada de manera exitosa en forma de agregados enzimáticos entrecruzados, reteniendo más del 92,3 ± 0,7 % de su actividad de β-xilosidasa original. Aunque los valores de pH y temperatura para la actividad máxima después de la inmovilización se mantuvieron sin cambios (pH 6,5 y 65 ◦C), se encontró una mejora en la estabilidad frente al pH y en la termoestabilidad, así como un aumento importante en la estabilidad operacional después de la inmovilización. El análisis de los parámetros cinéticos muestra que el valor KM de XynB2^Y509E-CLEAs obtenido fue ligeramente superior que la de XynB2^Y509E libre (1,2 frente a 0,9 mM). Como un hecho notable, la actividad de xilanasa desarrollada por la mutación también se conservó después del proceso de inmovilización. La enzima XynB2^Y509E también fue inmovilizada sobre esferas de quitosano, utilizando dos métodos para ello: el atrapamiento y la formación de enlaces covalentes por modificación del soporte con glutaraladehído. La enzima inmovilizada por atrapamiento mostró mejoras en los parámetros de estabilidad operacional con respecto a la enzima libre: mantiene más del 80% de su actividad luego de su incubación por 1 h a pH 8, exhibe mayor termoestabilidad ya que preserva su actividad en más del 90% después de 1h de pre-incubación a 70°C, presenta un 45% de su actividad inicial tras 2 meses de almacenamiento a 4°C y 50% de la actividad enzimática original tras 10 ciclos de reuso. La enzima inmovilizada por enlace covalente sobre esferas de quitosano modificado con glutaraldehído muestra una estabilidad térmica superior a la enzima libre y a la enzima inmovilizada por atrapamiento ya que después de 1 h de incubación a 70°C preserva el 100% de su actividad, incluso conserva hasta el 30% de la actividad inicial luego de permanecer 1 h a 80°C. La retención de la actividad catalítica dual solo se mantuvo en la inmovilización por enlaces covalentes. Los resultados obtenidos en esta tesis doctoral sugieren que las formas de XynB2^Y509E inmovilizadas, como CLEAS y en quitosano, son más estables que la enzima libre, confirmando la idoneidad de la inmovilización como herramienta para incrementar la estabilidad operacional del biocatalizador.

URI: http://hdl.handle.net/123456789/9399

Date: 2022-08

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